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IPTG(367-93-1)诱导蛋白表达的原理及方法步骤

    E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

    1、诱导表达材料

    (1)LB(Luria—Bertani))培养基

    酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%

    蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围:大肠杆菌

    (2)IPTG贮备液:2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存。

    (3)l×凝胶电泳加样缓冲液:50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%溴酚蓝10%甘油

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

    1)酶溶法(1)裂解缓冲液:

    50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI

    (2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。(3)10mg/mL溶菌酶。(4)脱氧胆酸。

    (5)1mg/mLDNaseI。2)超声破碎法(1)TE缓冲液。

    (2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液:100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油实验方案

    1、外源基因的诱导表达

    (1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

    (3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序列测定,确定无误后进行下一步。

    (4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。

    (5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测。

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1)细菌的裂解

    常用方法有:①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

    (1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:

    ①4℃,5000rpm离心,15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL)。弃上清,约每克湿菌加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀。


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IPTG(367-93-1)诱导蛋白表达的原理及方法步骤

作者:湖南韵邦生物医药有限公司 浏览: 发表时间:2021-03-11 13:57:34

    E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

    1、诱导表达材料

    (1)LB(Luria—Bertani))培养基

    酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%

    蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围:大肠杆菌

    (2)IPTG贮备液:2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存。

    (3)l×凝胶电泳加样缓冲液:50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%溴酚蓝10%甘油

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

    1)酶溶法(1)裂解缓冲液:

    50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI

    (2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。(3)10mg/mL溶菌酶。(4)脱氧胆酸。

    (5)1mg/mLDNaseI。2)超声破碎法(1)TE缓冲液。

    (2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液:100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油实验方案

    1、外源基因的诱导表达

    (1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

    (3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序列测定,确定无误后进行下一步。

    (4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。

    (5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测。

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1)细菌的裂解

    常用方法有:①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

    (1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:

    ①4℃,5000rpm离心,15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL)。弃上清,约每克湿菌加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀。


IPTG(367-93-1)诱导蛋白表达的原理及方法步骤

作者:湖南韵邦生物医药有限公司 浏览: 发表时间:2021-03-11 13:57:34

    E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

    1、诱导表达材料

    (1)LB(Luria—Bertani))培养基

    酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%

    蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围:大肠杆菌

    (2)IPTG贮备液:2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存。

    (3)l×凝胶电泳加样缓冲液:50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%溴酚蓝10%甘油

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

    1)酶溶法(1)裂解缓冲液:

    50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI

    (2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。(3)10mg/mL溶菌酶。(4)脱氧胆酸。

    (5)1mg/mLDNaseI。2)超声破碎法(1)TE缓冲液。

    (2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液:100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油实验方案

    1、外源基因的诱导表达

    (1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

    (3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序列测定,确定无误后进行下一步。

    (4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。

    (5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测。

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1)细菌的裂解

    常用方法有:①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

    (1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:

    ①4℃,5000rpm离心,15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL)。弃上清,约每克湿菌加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀。


IPTG(367-93-1)诱导蛋白表达的原理及方法步骤

作者:湖南韵邦生物医药有限公司 浏览: 发表时间:2021-03-11 13:57:34

    E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

    1、诱导表达材料

    (1)LB(Luria—Bertani))培养基

    酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%

    蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围:大肠杆菌

    (2)IPTG贮备液:2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存。

    (3)l×凝胶电泳加样缓冲液:50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%溴酚蓝10%甘油

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

    1)酶溶法(1)裂解缓冲液:

    50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI

    (2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。(3)10mg/mL溶菌酶。(4)脱氧胆酸。

    (5)1mg/mLDNaseI。2)超声破碎法(1)TE缓冲液。

    (2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液:100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油实验方案

    1、外源基因的诱导表达

    (1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

    (3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序列测定,确定无误后进行下一步。

    (4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。

    (5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测。

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1)细菌的裂解

    常用方法有:①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

    (1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:

    ①4℃,5000rpm离心,15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL)。弃上清,约每克湿菌加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀。


IPTG(367-93-1)诱导蛋白表达的原理及方法步骤

作者:湖南韵邦生物医药有限公司 浏览: 发表时间:2021-03-11 13:57:34

    E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

    1、诱导表达材料

    (1)LB(Luria—Bertani))培养基

    酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%

    蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围:大肠杆菌

    (2)IPTG贮备液:2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存。

    (3)l×凝胶电泳加样缓冲液:50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%溴酚蓝10%甘油

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

    1)酶溶法(1)裂解缓冲液:

    50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI

    (2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。(3)10mg/mL溶菌酶。(4)脱氧胆酸。

    (5)1mg/mLDNaseI。2)超声破碎法(1)TE缓冲液。

    (2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液:100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%溴酚蓝20%甘油实验方案

    1、外源基因的诱导表达

    (1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

    (3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序列测定,确定无误后进行下一步。

    (4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。

    (5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测。

    2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1)细菌的裂解

    常用方法有:①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

    (1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:

    ①4℃,5000rpm离心,15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL)。弃上清,约每克湿菌加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀。


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